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BCA 蛋白定量计算器（标准曲线拟合与样品浓度）
把 BSA 标准品和样品的 A562 读数填进来（复孔用逗号分开），马上得到拟合方程、R² 和每个样品乘过稀释倍数的蛋白浓度。
输入
拟合方式
BSA 标准品
浓度 (μg/mL)A562
复孔用逗号或空格分开，自动取平均。
结果
A = 0.000869 + 0.000844 × C − 1.11×10⁻⁷ × C²
- R²
- 0.99997
- 空白
- 0.095
- 标准品范围
- 25 到 2000 μg/mL
样品
| 名称 | A562 | 稀释倍数 | 曲线浓度 | 原样品浓度 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 591 μg/mL | 2.96 mg/mL | ||||
| 395 μg/mL | 1.98 mg/mL |
公式
扣空白：A = A562(孔) − A562(0 μg/mL 平均)
二次拟合：A = a + b × C + c × C²
直线拟合：A = a + b × C，C = (A − a) ÷ b
原样品浓度 = 曲线浓度 × 稀释倍数
提示: 标准品和样品同板、同时孵育、同时读 562 nm。样品吸光度超出标准品范围时不给结果，调整稀释后重测。
这一步算对了，但整个实验有几十个参数联动。改一个稀释倍数，下游全要重算。在 Vara 里把整套实验的参数连起来，改一个自动重算全部。免费管理 3 个实验。
公式怎么来的
- 配工作液：试剂 A 和试剂 B 按 50:1 混匀，刚加 B 时会浑浊，混匀后变成透明绿色。
- 微孔板每孔加 25 μL 标准品或样品和 200 μL 工作液，37 °C 孵育 30 分钟，冷却到室温后读 562 nm。
- 扣空白：每孔读数减去 0 μg/mL 孔的平均值，复孔先取平均。
- 用扣过空白的标准品拟合 A 与浓度 C 的关系：直线 A = a + b × C，或二次 A = a + b × C + c × C²。
- 样品的 A 代回曲线反解出 C；二次曲线取随浓度上升的那一段的根。
- 反解出的 C 是孔里的浓度，乘以测定前的稀释倍数，得到原样品浓度。
算例
算例 1：二次拟合算裂解液浓度
- 九个标准品双复孔，0 μg/mL 两孔读数 0.094 和 0.096，空白 = 0.095。
- 样品 A 测定前稀释 5 倍，两孔读数 0.552 和 0.560，平均 0.556，扣空白后 0.461。
- 二次拟合：A = 0.000869 + 0.000844 × C − 1.11×10⁻⁷ × C²，R² = 0.99997。
- 代入 A = 0.461 反解，曲线浓度 591 μg/mL。
- 原样品浓度 = 591 μg/mL × 5 = 2.96 mg/mL。
算例 2：同一组数据换成直线拟合
- 直线拟合：A = 0.0549 + 0.000627 × C，R² = 0.99009，看起来也很高。
- 样品 A 曲线浓度 648 μg/mL，原样品 3.24 mg/mL，比二次拟合高出约 10%。
- 差别来自高浓度端的弯曲：直线被 1500、2000 μg/mL 两点压平，中段读数就偏了。
算例 3：每孔上样 20 μg 蛋白取多少
- 按算例 1，原样品 2.96 mg/mL，也就是每 μL 含 2.96 μg 蛋白。
- 上样 20 μg：20 ÷ 2.96 ≈ 6.76 μL 裂解液，再用上样缓冲液补到同一体积。
常见错误
标准品和样品不同时读板
BCA 没有终点，颜色一直在变。标准品先读、样品后读，两者对应的显色时间不同，算出的浓度会系统性偏高。
超出标准曲线还外推
高于 2000 μg/mL 或低于最低标准品的读数落在曲线之外，外推出来的数字不可靠。应该调整稀释倍数后重测。
只看 R² 就选直线
本页默认算例里，全量程直线拟合的 R² 是 0.990，样品浓度却比二次拟合高约 10%。R² 高不代表中段读数准，全量程用二次拟合，或者只用线性好的那一段标准品。
标准品和样品用的缓冲液不一样
裂解液里的还原剂（DTT、β-巯基乙醇）和螯合剂（EDTA）会干扰显色。标准品用水配、样品在含这些成分的裂解液里，曲线就不能直接套用。标准品用和样品同样的裂解液配。
忘了乘稀释倍数
曲线读出的是孔里的浓度。测定前稀释了 5 倍，原样品就是读数的 5 倍，漏乘会让上样量多 5 倍。
常见问题
BCA 标准曲线用哪些 BSA 浓度？+
Thermo Pierce BCA (23225) 说明书微孔板法用 2000、1500、1000、750、500、250、125、25、0 μg/mL 九个 BSA 标准品，0 μg/mL 作空白。标准法的线性工作范围是 20 到 2000 μg/mL。样品浓度心里没数时，先做两三个稀释度一起测。
空白要扣吗？怎么扣？+
要扣。每个标准品孔和样品孔都减去 0 μg/mL 孔的平均 A562，再用扣过空白的标准品拟合曲线，0 点本身不再参与拟合。本页勾选「扣空白」后自动处理。空白孔要用和样品一样的缓冲液或裂解液配。
直线拟合还是二次拟合？+
标准品覆盖 25 到 2000 μg/mL 全范围时，BCA 曲线在高浓度端会弯，直线拟合会让中段样品偏差变大，用二次拟合更贴合。本页默认算例里，同一个样品直线拟合比二次拟合高出约 10%。判断时看 R²，也看标准品自己回算的浓度和标称值差多少。
样品吸光度超出标准曲线怎么办？+
不要外推。高于最高标准品，把样品多稀释几倍重测，结果乘上新的稀释倍数；低于最低的非零标准品，少稀释一些，或者换增强法（60 °C 孵育 30 分钟，工作范围 5 到 250 μg/mL）。本页对超出范围的样品不给浓度。
稀释倍数怎么算进去？+
测定前稀释了几倍就填几倍。例如 10 μL 裂解液加 40 μL 稀释液是 5 倍稀释，曲线上读到 591 μg/mL，原样品就是 591 × 5 = 2955 μg/mL，约 2.96 mg/mL。没稀释就留空，按 1 倍算。
哪些成分会干扰 BCA？+
还原剂（DTT、β-巯基乙醇）和螯合剂（EDTA）会干扰 BCA 显色，Thermo TR0008 技术说明里样品含 5 mM DTT 就会干扰。处理办法：换兼容还原剂的 BCA 试剂盒，用 TCA 或丙酮沉淀去掉干扰物，或者透析、稀释。标准品最好用和样品同样的裂解液配。
为什么标准品和样品要同时读板？+
BCA 反应没有真正的终点，孵育结束后颜色还会继续加深。所以标准品必须和样品在同一块板上、同时孵育，37 °C 孵育 30 分钟后尽快一起读 562 nm。先读标准品、过一阵再读样品，曲线就对不上了。
BCA 测准了，为什么 WB 内参还是一高一低？+
定量只是第一步。上样移液误差、样品煮完没离心有沉淀、转膜不均、内参信号饱和都会让条带不齐。GAPDH、β-actin 这类高丰度内参在常规上样量下可能已经超出线性范围，最好做上样梯度确认信号在线性区间，或者用丽春红、总蛋白染色归一化。